Question

【題目】如圖為三種質粒和一個含目的基因的DNA片段，其中ApR為氨芐青霉素抗性基因，TcR為四環素抗性基因，lacZ為藍色顯色基因，EcoR Ⅰ(0.7 kb)、Pvu Ⅰ(0.8 kb)等為限制酶切割位點，括號內的數據是該切點與復制原點的距離。已知1 kb＝1 000個堿基對，請回答下列問題：

(1)片段D為目的基因中的某一片段，則下列酶能形成或斷裂圖中②所示化學鍵的有_________(多選填字母)。

a、限制性核酸內切酶 b、DNA連接酶 c、Taq酶 d、解旋酶 e、DNA水解酶

(2)若想獲得大量的目的基因，可采用________法進行擴增，含目的基因的DNA片段共經過______次循環后剛好能形成等長的目的基因片段，復制n次需要提供特異性引物對______對。

(3)圖中作為目的基因運載體最理想的質粒是________(填“A”“B”或“C”)，請據圖分析，其他兩種質粒一般不能作為運載體的理由分別是________________________________

(4)用EcoR Ⅰ全酶切目的基因和質粒B形成的重組質粒，并進行電泳觀察，可出現長度分別為1.1 kb和______kb的兩個片段，或者長度分別為_________的兩個片段(重組質粒上目的基因的插入位點與EcoR I的識別位點之間的堿基對忽略不計)。

(5)將分別用限制酶Pvu Ⅰ切開的質粒B溶液與目的基因溶液混合，加入DNA連接酶后，進行大腸桿菌受體細胞導入操作，則受體細胞的類型（對抗生素表現出抗性R或敏感性S，藍白代表菌落顏色）包含________(多選填字母)。

A．ApR、藍色　　　B．ApR、白色 C．ApS、藍色 D．ApS、白色

Answer 1

【答案】abce PCR 3 2n-1 B 質粒A不含有標記基因；質粒C在用和目的基因相同的限制酶切割時，復制原點會被破壞，使該質粒無法進行復制 5.6 3.6 kb和3.1 kb ABD

【解析】

基因工程的工具：限制酶、DNA連接酶、運載體。

基因工程的操作步驟：目的基因的獲取、構建基因表達載體、把目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測和鑒定。

含ApR、TcR的細胞表達后對氨芐青霉素、四環素存在抗性；lacZ為藍色顯色基因，故含有完整lacZ的細胞會顯示藍色，不含lacZ的細胞會顯示白色。

D中①氫鍵、②磷酸二酯鍵。

(1)限制性核酸內切酶和DNA水解酶破壞②磷酸二酯鍵；DNA連接酶、Taq酶催化②磷酸二酯鍵的形成；解旋酶會破壞①氫鍵。故選abce。

(2)若想獲得大量的目的基因，可采用PCR進行擴增，該過程需要耐高溫的DNA聚合酶參與，需要2種引物，含目的基因的DNA片段共經過3次循環后才能形成等長的目的基因片段，每條新的子鏈延伸均需引物，故復制n次需要提供特異性引物對為：（2n+1-2）÷2=2n-1對。

(3)圖中質粒A不含有標記基因；質粒C在用和目的基因相同的限制酶切割時，復制原點會被破壞，使該質粒無法進行復制，故不適合作為基因工程的運載體，作為目的基因運載體最理想的質粒是B，目的基因插入后不會破壞復制原點和ApR。

(4)由圖可知，目的基因和質粒B只能用限制酶PvuⅠ進行切割，切割后目的基因的長度為4kb，其中含有的EcoR I的識別位點距離兩端的PvuⅠ切點的距離分別是1kb或3kb；質粒上的PvuⅠ切點距離EcoR I的識別位點的最短距離是0.1kb，目的基因和質粒進行連接時可能正向連接或反向連接，故用EcoR Ⅰ全酶切目的基因和質粒B形成的重組質粒，并進行電泳觀察，會出現長度分別為1.1 kb和5.6kb的兩個片段，或者長度分別為3.6 kb和3.1 kb的兩個片段。

(5)將分別用限制酶Pvu Ⅰ切開的質粒B溶液與目的基因溶液混合，加入DNA連接酶后，進行大腸桿菌受體細胞導入操作，則受體細胞的類型有未轉化的細胞，不含ApR、lacZ，顯示白色，ApS；轉化的細胞有：只含目的基因的細胞，不含ApR、lacZ，顯示白色，ApS；只含質粒B的細胞，含ApR、lacZ，顯示藍色，對氨芐青霉素有抗性；含重組質粒的細胞，含ApR、不含lacZ，表現為ApR、白色。故選ABD。