Question

【題目】如圖為某種質粒表達載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性內切酶EcoRI、BamHI、SamI的酶切位點，P為啟動子，T為終止子，ori為復制原點。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRI、BamHI、SamI在內的多種酶的酶切位點。外源DNA插入到ampR或tctR中會導致相應的基因失活（ampR表示氨芐青霉素抗性基因，tctR表示四環素抗性基因）。回答下列問題：

（1）目的基因主要是指編碼蛋白質的基因，也可以是一些_________。在基因工程中使用的載體除質粒外，還有___________、動植物病毒等，它們來源不同，在大小、結構、復制以及插入片段大小上也有很大差別。

（2）一般為避免在構建重組質粒時出現自身環化，該質粒用限制酶切割時應該用________酶進行切割，切割過程中消耗了___________個水分子。目的基因進入受體細胞內，并在受體細胞內維持穩定和表達的過程，稱之為_____________________。構建出來的基因表達載體在受體細胞內表達時，RNA聚合酶識別和結合位點是____________。

（3）若將此質粒用EcolR I酶切割后，與用EcolR I酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化大腸桿菌（大腸桿菌本身不含該質粒），結果大腸桿菌有的未被轉化，有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是含有環狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌。其中，可在含氨芐青霉素的培養基上生存下來的大腸桿菌是____________，能在同時含氨芐青霉素和四環素的培養基上生存的是______________。

（4）假如該質粒載體為來自土壤農桿菌的Ti質粒，將其攜帶的抗蟲基因整合到某植物細胞的染色體DNA上，將該細胞通過植物組織培養技術培育成植株后，發現其并無抗蟲特性，其可能的原因是__________（答出1種情況即可）

Answer 1

【答案】 具有調控作用的因子 λ噬菌體的衍生物 EcoRI、BamHI酶 4 轉化 啟動子（或P） 含有質粒載體和含有插入了目的基因的重組質粒的 含有質粒載體 抗蟲基因并未表達（或未轉錄或未翻譯）；抗蟲基因表達的水平極低或產生的抗蟲蛋白沒有活性

【解析】試題分析：用EcoRI酶切出的目的基因和質粒具有相同的黏性末端，如果放在一起加入DNA連接酶，則可出現3種連接結果．載體自身形成的連接物能重新形成完整的tetR基因，具有抗四環素的特點，其他連接物中tetR基因被限制性內切酶破壞，不再具有抗四環素的特點；在整個操作過程中，ampR基因保持完整，載體（質粒）自身連接形成的連接物和目的基因-載體連接物（重組質粒）都具有抗青霉素的特性。

（1）目的基因主要是指編碼蛋白質的基因，也可以是一些具有調控作用的因子。基因工程中運輸目的基因的載體，常見的有質粒、λ噬菌體的衍生物和動植物病毒。

（2）根據題干信息和圖形分析，目的基因兩端有EcoRI酶切點和BamHI酶切點，在質粒載體上也有這兩種酶的切點，所以可以用這兩種酶切出非同源性互補末端來阻止其他連接。切割質粒時有兩個切點，破壞了4個磷酸二酯鍵，所以消耗了4分子的水。轉化指的是目的基因進入受體細胞內，并在受體細胞內維持穩定和表達的過程。啟動子是RNA聚合酶識別和結合位點，啟動轉錄過程。

（3）含有質粒載體和含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌都含有氨芐青霉素抗性基因，所以都可以在氨芐青霉素的培養基上生存下來，其中能在同時含氨芐青霉素和四環素的培養基上生存的是含有質粒載體的大腸桿菌。

（4）轉基因技術獲得的植物沒有抗蟲特性，可能是基因沒有選擇性表達，有可能抗蟲基因表達的水平極低或產生的抗蟲蛋白沒有活性。