Question

【題目】VNN1基因（1542bp）與炎癥相關性疾病有關，GFP基因（4735bp）控制綠色熒光蛋白的合成，該蛋白可在相應波長的紫外光激發下發出綠色熒光。某研究小組進行鼠源GFP - VNNI重組質粒的構建及其功能研究，回答下列問題：

（l）為構建重組質粒，研究小組從數據庫查找到VNNl的DNA序列，并設計引物。上游引物：5-AAGCTTCCGCTGCACCATGACTACTC-3下劃線為HindⅢ酶切位點），下游引物：5-GGATCCGCTCGAGCTACCAACTTAATGA-3（下劃線為BamHI酶切位點），之后進行PCR擴增，PCR的原理是________。擴增后的VNNI基因要與含GFP基因的載體連接，需用________（填具體酶）切割VNNI基因和含GFP基因的載體，再用________酶處理，構建重組質粒。

（2）GFP基因在重組質粒中可作為________________，其作用是________。用之前相同的限制酶對GFP - VNNI重組質粒切割后，進行電泳鑒定時得到如圖1所示的部分條帶，結果表明________。

（3）IL -6為體內重要的炎癥因子，能與相應的受體結合，激活炎癥反應。圖2為GFP-VNNI重組質粒對細胞分泌IL -6的影響，由此說明________________，同時發現與正常組比較，空質粒轉染組IL-6的表達有輕微升高，造成這種現象的可能原因是________________________。

Answer 1

【答案】DNA雙鏈復制 HindⅢ酶和BamHⅠ酶 DNA連接 標記基因 鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含目的基因的細胞篩選出來 VNN1基因已插入到含GFP基因的載體中（合理即可） VNN1基因表達產物能促進細胞分泌炎癥因子IL-6 操作過程中對細胞的損傷（或用到的化學試劑對細胞具有一定的毒性作用），可以激活相應細胞分泌炎癥因子IL-6

【解析】

基因工程的基本操作程序

第一步：目的基因的獲取：原核基因采取直接分離獲得，真核基因是人工合成，人工合成目的基因的常用方法有反轉錄法和化學合成法。

第二步：基因表達載體的構建

第三步：將目的基因導入受體細胞

常用的轉化方法：

將目的基因導入植物細胞：采用最多的方法是農桿菌轉化法，其次還有基因槍法和 花粉管通道法等。

將目的基因導入動物細胞：最常用的方法是 顯微注射技術；

將目的基因導入微生物細胞：先用 Ca2+處理細胞，使其成為感受態細胞，再將重組表達載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態細胞混合，在一定的溫度下促進感受態細胞吸收DNA分子，完成轉化過程。

第四步：目的基因的檢測和表達。

（1）PCR的原理是DNA雙鏈復制，為防止切割的質粒環化，通常選擇兩種的限制酶進行切割，同時需要用相同的限制酶對目的基因進行處理，所以選擇HindⅢ酶和BamHI切割VNNI基因和含GFP基因的載體，再用DNA連接酶處理形成重組質粒。

（2）GFP基因（4735bp）控制綠色熒光蛋白的合成，該蛋白可在相應波長的紫外光激發下發出綠色熒光，所以在重組質粒中可以作為標記基因；鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含目的基因的細胞篩選出來；電泳條帶顯示分子量增加表明VNN1基因已插入到含GFP基因的載體中。

（3）從柱狀圖中看出VNN1組中IL-6的濃度增加，說明了VNN1基因表達產物能促進細胞分泌炎癥因子IL-6；空質粒轉染組IL-6的表達有輕微升高，可能原因是操作過程中對細胞的損傷（或用到的化學試劑對細胞具有一定的毒性作用），可以激活相應細胞分泌炎癥因子IL-6。