Question

【題目】下表是幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖 1、圖 2 中標注了相關限制酶的酶切位點，其中切割位點相同的酶不重復標注。請回答下列問題：

(1)用圖中質粒和目的基因構建重組質粒，應選用____________________兩種限制酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過______________酶作用后獲得重組質粒。為了擴增重組質粒，需將其轉入經____________處理過的_____________態(tài)的大腸桿菌中。

(2)為了篩選出轉入了重組質粒的大腸桿菌，應在篩選平板培養(yǎng)基中添加________________________。平板上長出的菌落，常用 PCR 鑒定，所用的引物組成為圖2中的_____________。

(3)若BamH I 酶切的 DNA 末端與 Bcl I 酶切的 DNA 末端連接，連接部位的 6 個堿基對序列為______________________，對于該部位，這兩種酶__________（填“都能”、 “都不能”或“只有一種能”）切開。

(4)若用 Sau3A I 切圖 1 質粒最多可能獲得________________種大小不同的 DNA 片段。

(5)圖1中啟動子的作用是__________________________________________________________。

(6)將目的基因導入棉花細胞，培育抗蟲棉的過程涉及到哪些技術：_______________________________

Answer 1

【答案】Bcl I和Hand IIIDNA連接Ca+感受四環(huán)素引物甲和引物丙都不能7為RNA聚合酶提供識別和結合的部位，驅動轉錄基因工程技術(轉基因技術)和植物組織培養(yǎng)技術

【解析】

分析圖1：外源DNA上含有限制酶BclI、BamHⅠ、HindIII和Sau3AI的切割位點，其中限制酶BclI、BamHⅠ、HindIII的識別序列都能被Sau3kI識別。分析圖2：質粒上有限制酶BclI、BamHⅠ、HindIII三種限制酶的識別序列和切割位點，其中BamHⅠ的切割位點位于兩種抗生素抗性基因上，而抗性基因為載體的標記基因，因此不可用該酶切割。在目的基因上，BclⅠ、BamHI、HindⅢ和Sau3AⅠ四種酶也存在酶切位點。

（1）選擇的限制酶應在目的基因兩端存在識別位點，但BamHⅠ可能使質粒中的啟動子丟失，且會破壞質粒中的兩個抗性基因；Sau3AI在質粒上有三個酶切位點，也會破壞質粒中的兩個抗性基因，不利于后期的篩選，所以應選用限制酶為BclⅠ和Hind Ⅲ。選擇的限制酶應在目的基因兩側切割，切割后的DNA片段用DNA連接酶連接。為了擴增重組質粒，需將其轉入經鈣離子處理過的感受態(tài)的大腸桿菌中。

（2）由上一問的討論可知，重組質粒的氨芐青霉素抗性基因已經破壞，僅保留了四環(huán)素抗性基因，為了篩選出轉入了重組質粒的大腸桿菌，應在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素。平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈，引物需要與單鏈兩端相應互補序列結合，故所用引物組成是圖2中的引物甲和引物丙。

（3）若BamHⅠ酶切的DNA末端和BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個堿基對序列為，由于兩種酶均不能識別該部位的堿基對序列，所用兩種酶都不能切開該部位。

（4）根據BclI、BamHⅠ和Sau3AⅠ的酶切位點，Sau3AⅠ在質粒上有三個酶切位點，完全酶切可得到記為A、B、C三種片段，若部分位點被切開，可得到AB、AC、BC、ABC四種片段，所以用Sau3AⅠ切質粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段。

（5）啟動子的作用是為RNA聚合酶提供識別和結合的部位，驅動轉錄。

（6）將目的基因導入棉花細胞，需要基因工程技術(轉基因技術)；將得到的轉基因細胞培育成抗蟲棉植株的過程涉及到植物組織培養(yǎng)技術。