Question

【題目】欒樹適合生長于石灰石風化產生的鈣基土壤中，抗惡劣環境的能力強，因此常用于礦區廢棄地恢復過程中的種植。為了增加欒樹的耐旱性，某科研所將耐旱基因導入欒樹中，流程圖如圖所示，回答下列問題：

限制酶	BamHI	HindⅢ	EcoRI
識別序列及切割位點	G↓GATCC CCTAG↑G	A↓AGCTT TTCGA↑A	G↓AATTC CTTAA↑G

（1）構建重組質粒的過程中，為了避免目的基因和載體切割后產生的末端發生任意鏈接，應選擇限制酶_______________分別切割載體和含目的基因的DNA片段，完全酶切后產生的DNA片段分別為_____________，經DNA連接酶連接后，可以得到___________種重組質粒。

（2）如果將耐旱基因直接導入欒樹細胞，一般情況下，欒樹不會具有耐旱特性，原因是耐旱基因在欒樹細胞中不能___________，也不能___________。

（3）耐鹽基因應插入到農桿菌________________上，通過轉化作用進入欒樹細胞并整合到________，這是__________________________________的關鍵。

（4）要獲得大量該耐鹽基因，可利用PCR技術進行擴增，圖2為引物對與模板結合示意圖，擴增的第5次，需要_________個引物。表1為根據模板設計的兩對引物序列，請判斷哪一對引物可采用較高的退火溫度？________。

引物對 A	P AACTGAAATGTAGCTATC P TTAAGTCCATTACTCTAG
引物對 B	S GTCCGACTAGTGGCTGTG S AGCTGGCGTTTAGCCTCG

Answer 1

【答案】BamHⅠ和HindⅢ 3和4 2 穩定存在（復制） 表達 Ti質粒的T-DNA上 染色體DNA上 目的基因能否在受體細胞中穩定遺傳的關鍵 32 引物對B

【解析】

分析題圖：含目的基因的DNA和質粒上均有HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位點，但EcoRⅠ酶切位點位于目的基因上，切割會破壞目的基因，BamHⅠ酶切割質粒自身環化，用BamHI 和HindⅢ酶對外源DNA和質粒進行切割。

（1）由分析可知，為了避免目的基因和載體切割后產生的末端發生任意鏈接，需要使用 HindⅢ和BamHⅠ在Ti質粒上進行切割。質粒上有2個HindⅢ的酶切位點，有1個BamHⅠ的酶切位點，完全酶切后質粒上的DNA片段為3；目的基因上有一個HindⅢ和兩個BamHⅠ的酶切位點，完全切割后產生的DNA片段為4。使用使用 HindⅢ和BamHⅠ酶切后，目的基因有2個片段均可以與質粒連接，因此經DNA連接酶連接后，可以得到2種重組質粒。

（2）如果將耐旱基因直接導入欒樹細胞，一般情況下，培育出的欒樹植株不具有耐旱特性，原因是耐旱基因在欒樹細胞中不能復制和表達，所以需要構建基因表達載體。

（3）耐旱基因應插入到農桿菌Ti質粒的T—DNA上，通過轉化作用進入欒樹細胞并整合到染色體DNA上，使耐旱基因能穩定維持并發揮作用，這也是目的基因能否在受體細胞中穩定遺傳的關鍵。

（4）擴增4次，含有16個DNA分子，DNA為雙鏈，則擴增第5次需要32個引物。退火溫度必須根據引物的堿基數量和種類來設定，引物對B中G/C堿基含量較高，可采用較高的退火溫度。