Question

【題目】閱讀下面的材料，完成（1）～（5）題。

科研人員建立了一種新的靶向基因敲除技術——TALEN技術（原理見下圖）。TALEN技術使用的基因敲除工具是由DNA識別域和核酸內切酶兩個部分組成的蛋白質。科學家發現了一種細菌蛋白質（TALE），它的二連氨基酸（NI、NG、HD、NN，其中字母N、I、G、H、D分別代表了一種氨基酸）與四種堿基（A、G、C、T）有恒定的對應關系：NI識別A，NG識別T，HD識別C，NN識別G。FokⅠ是一種形成二聚體后具有核酸內切酶活性的蛋白單體。因此，可以利用TALE作為DNA識別域，用FokⅠ二聚體定點切斷DNA。

科學家發現水稻植株無論是否具有光周期敏感蛋白基因P，在短日照條件下均表現為雄性可育。在長日照條件下，具有光周期敏感蛋白的水稻才能雄性可育。基因P只在單倍體花粉細胞中表達，使其能夠合成淀粉。科研人員使用TALEN技術對水稻基因P進行靶向敲除，以得到光敏雄性不育水稻新品種。

（1）在TALEN技術的設計中，選擇使用FokⅠ單體而不直接使用FokⅠ二聚體，這樣能減少對DNA的__________切割，保證了基因敲除的靶向性。為了讓TALEN技術能用于各種不同生物、不同基因的敲除，沒有與TALE蛋白結合的FokⅠ二聚體對DNA的切割應__________（選填“具有”或“不具有”）類似于限制酶的“限制性”。

（2）若TALE蛋白左臂所識別的基因P的序列為“-TGACC-” ，則TALE蛋白左臂對應的二連氨基酸序列應為__________。用這種方法，可以確定TALE蛋白的氨基酸序列，進而人工合成TALE蛋白基因。然后將TALE蛋白基因與__________基因進行融合，得到融合基因。

（3）科研人員用圖2所示的質粒為載體，其中的潮霉素抗性作為標記基因，作用是__________。應選用__________酶將該質粒與融合基因構建為重組質粒，并將融合基因設法導入到水稻愈傷組織中，再利用__________技術獲得T0代植株。

（4）由于基因靶向敲除成功的概率比較低，所以科研人員培育T0代植株時應保證__________日照條件，待其自花受粉得到T1代，再將T1代植株__________，并在開花期隨機選擇一部分植株的花粉進行鑒定，鑒定方法是__________。若觀察到某植株的花粉全部未被染成藍色，則該植株為所需的純合光敏雄性不育新品種。

（5）與傳統的雄性不育水稻品種相比，光敏雄性不育新品種的優勢在于它能實現自交繁殖并保留雄性不育特性，這是因為__________。

Answer 1

【答案】非靶向（或“隨機”） 不具有 FokⅠ單體 篩選轉化成功的受體細胞 BamH Ⅰ及DNA連接 植物組織培養 短 在長日照下種植 將花粉用碘液染色后，在顯微鏡下觀察 光敏雄性不育新品種在短日照條件下雄性可育，可實現自交繁殖；自交后代能保持基因P敲除的純合性，使其在長日照條件下雄性不育

【解析】

分析題干的信息：細菌蛋白質（TALE）與四種堿基（A、G、C、T）有恒定的對應關系，FokⅠ是一種形成二聚體后具有核酸內切酶活性的蛋白單體。

水稻植株無論是否具有光周期敏感蛋白基因P，在短日照條件下均表現為雄性可育。在長日照條件下，具有光周期敏感蛋白的水稻才能雄性可育。

基因P只在單倍體花粉細胞中表達，使其能夠合成淀粉。

（1）如果使用FokⅠ二聚體，根據圖示，可以對靶基因的左側和右側序列進行隨機切割，所以為了較少對DNA的隨機（非靶向）切割，保證了基因敲除的靶向性。由于限制酶的特點是識別特定的序列并在特定的位點進行切割，所以應選擇不具有類似于限制酶的“限制性”。

（2）根據NI識別A，NG識別T，HD識別C，NN識別G，所以二連氨基酸序列應為，融合基因可以將TALE蛋白基因和FokⅠ單體基因進行融合，如果表達后就可以獲得具有特異性識別并且切割的酶。

（3）在基因工程中，標記基因的作用是篩選轉化成功的受體細胞，根據啟動子的啟動方向可知，用HindⅢ酶處理，目的基因插入的位置是表達不出來的，所以選擇BamHⅠ進行切割，并用同種酶處理目的基因，再用DNA連接酶形成重組質粒，將融合基因設法導入到水稻愈傷組織中后，在利用植物組織培養技術獲得T0代植株。

（4）由于在短日照條件下均表現為雄性可育，在長日照條件下，具有光周期敏感蛋白的水稻才能雄性可育，所以T0代應該保證短日照條件，獲得F1代后將其放入長日照下種植，淘汰沒有光周期蛋白的個體，然后進行花粉鑒定，因為基因P只在單倍體花粉細胞中表達，使其能夠合成淀粉，所以可以用碘液染色。

（5）由于光敏雄性不育新品種在短日照條件下雄性可育，可實現自交繁殖；自交后代能保持基因P敲除的純合性，使其在長日照條件下雄性不育，所以與傳統的雄性不育水稻品種相比，光敏雄性不育新品種的優勢在于它能實現自交繁殖并保留雄性不育特性。