Question

【題目】某植物抗蟲基因轉錄的mRNA下游序列已知，但其上游序列未知。現利用PCR技術擴增該基因，簡要流程如下圖所示，其中①③表示有關過程，ⅠⅢ表示有關物質。請回答下列問題：

（1）過程①反應體系中需要加入___________酶，生成雜合雙鏈物質Ⅰ。

（2）利用DNA末端轉移酶催化過程②，使cDNA單鏈左側末端增加十多個腺嘌呤脫氧核苷酸序列AAA(A)n，進而利于過程③擴增獲得目的基因序列Ⅲ。在過程③反應體系中還需要添加新的引物，新引物的堿基序列應該是________。

（3）得到物質Ⅲ后，通常還需在其兩端增加_________序列，以便切割后與相應的運載體重組。將基因表達載體導入大腸桿菌之前，還需用________處理大腸桿菌。

（4）在利用PCR技術擴增某DNA中的某一目的基因時，需要用到的酶是______，依據的原理是_______________。

Answer 1

【答案】逆轉錄 TTT(T)n 限制酶識別 Ca2+（CaCl2溶液） 熱穩定DNA聚合酶（Taq酶） DNA雙鏈復制（DNA復制）

【解析】

PCR是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。通過這一技術，可以在短時間內大量擴增目的基因。

基因工程的操作步驟：獲取目的基因；構建基因表達載體；把目的基因導入受體細胞；目的基因的檢測和鑒定。

（1）過程①以mRNA為模板合成DNA屬于逆轉錄過程，需要逆轉錄酶催化，生成雜合雙鏈物質Ⅰ（一條脫氧核苷酸鏈，一條核糖核苷酸鏈）。

（2）利用DNA末端轉移酶催化過程②，使cDNA單鏈左側末端增加AAA(A)n，故在過程③PCR反應體系中還需要添加新的引物，即與左側AAA(A)n互補的TTT(T)n作為引物。

（3）得到物質Ⅲ即目的基因后，通常還需在其兩端增加限制酶序列，以便利用限制酶和DNA連接酶構建基因表達載體。將基因表達載體導入大腸桿菌之前，還需用鈣離子處理大腸桿菌，使其處于感受態。

（4）PCR擴增時需要耐高溫的DNA聚合酶參與，PCR的原理是DNA雙鏈復制。